单环刺螠（Urechis unicinctus）交替氧化酶对硫化物应激的适应性反应

【摘要】外源硫化物对有机体可产生多种危害，包括破坏机体内蛋白质及核酸的结构、抑制线粒体呼吸链中细胞色素c氧化酶的活性从而阻断电子传递、进一步通过诱导氧自由基的产生和累积进而对机体产生损伤等。已知某些海洋无脊椎动物能够通过氧化解毒这些外源硫化物，然而当外源性硫化物阻断线粒体电子传递时，硫化物氧化产生的电子如何传递以避免氧自由基的积累产生的对细胞的损伤，迄今在动物中尚无深入的研究报道。在植物（如烟草）中，人们发现交替氧化酶在植物对抗逆境时发挥重要的作用，当线粒体经典电子传递途径受阻时，该酶将通过交替氧化途径传递电子。为了探究交替氧化酶（AlternativeOxidase，AOX）在海洋无脊椎动物适应硫化物中的作用，本文我们以耐硫的海洋无脊椎底栖动物单环刺螠为研究对象，通过体外原核表达系统获得AOX并制备多克隆抗体；采用间接竞争性ELISA、免疫组织化学和酶活性分析等技术揭示了单环刺螠AOX在4种主要组织器官（体壁、中肠、后肠和肛门囊）中的表达特征和功能，进一步分析了在硫化物环境中单环刺螠组织器官AOX的适应性反应。结果显示：本实验构建了原核表达载体pET28a-AOX并成功导入大肠杆菌中获得重组表达的AOX包涵体。用纯化的重组AOX免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体后，采用免疫印迹实验在单环刺螠组织总蛋白和线粒体中检测到明显的AOX，在体内该蛋白的分子量约40kDa。免疫组织化学技术检测单环刺螠各组织AOX的细胞学定位结果显示：AOX主要在各器官的上皮组织中表达。间接竞争性ELISA检测，单环刺螠AOX在体壁、中肠、后肠和肛门囊中均有表达，以后肠中含量最高，但4种组织之间的AOX含量没有显著性差异；酶活性检测发现，后肠中AOX的酶活性显著高于其他3个组织（p<0.05）。当单环刺螠暴露在硫化物（50μmol·L-1和150μmol·L-1）环境中时，其各组织器官AOX的蛋白含量和酶活性水平均随着硫化物浓度的提高和暴露时间的延长而提高。150μmol·L-1硫化物处理组的单环刺螠各器官AOX蛋白含量和酶活性绝大多数高于相同处理时间下的50μmol·L-1组。结合已报道的单环刺螠硫化物应激下细胞色素c氧化酶活性的变化，本文进一步讨论了单环刺螠AOX在不同浓度硫化物暴露下的作用，提出AOX可能作为单环刺螠硫化物应激下的第二个电子传递者，在螠虫甚至海洋无脊椎动物适应逆境时发挥重要的作用。
【作者】任志强；
【导师】张志峰；
【作者基本信息】中国海洋大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】单环刺螠；硫化物；交替氧化酶；交替氧化途径；线粒体电子传递链；

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